摘要

　　分析疫苗或感染免疫反應(yīng)的限速步驟之一是單克隆抗體的分離和鑒定。因此，我們提出了一種混合結(jié)構(gòu)和生物信息的方法，直接分配重鏈和輕鏈，識(shí)別和補(bǔ)充決定區(qū)域，并從多克隆抗體的低溫電子顯微鏡密度圖中找到序列，該密度圖與下一代免疫庫測(cè)序相結(jié)合，我們可以特別識(shí)別和復(fù)制家庭成員，生成單克隆抗體，并確認(rèn)它們以與相應(yīng)的多克隆抗體相同的方式與抗原相互作用。這種基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)是從多克隆血清中識(shí)別單克隆抗體的開始。

　　簡(jiǎn)介

　　全面分析感染或疫苗接種的免疫反應(yīng)既費(fèi)力又昂貴。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等經(jīng)典血清方法(ELISA)以及病毒中和試驗(yàn)，提供了豐富的信息，但需要一套相對(duì)較多的生物和病毒試劑。為了合理和基于結(jié)構(gòu)的疫苗設(shè)計(jì)，還需要將疫苗/病原菌引起的特異性單克隆抗體分離出來。(mAbs)，然而，抗原特異性B細(xì)胞的分離需要熒光標(biāo)記探頭和先進(jìn)的細(xì)胞分離設(shè)備。然后進(jìn)一步整合和評(píng)估單克隆抗體的結(jié)構(gòu)和功能，以評(píng)估表格的特異性、親和力和活性(即中和能力)。所選抗體的高分辨率結(jié)構(gòu)通常在這個(gè)過程結(jié)束后進(jìn)行，需要為每個(gè)獨(dú)特的樣本獲得獨(dú)立的數(shù)據(jù)。

　　最近，我們開發(fā)了一種使用低溫電子顯微鏡的方法。(cryoEM)以免疫血清的程度表征疫苗接種或感染(cryoEMPEM)導(dǎo)致多克隆抗體(pAb)反應(yīng)。我們可以很容易地從單個(gè)cryoEMPEM數(shù)據(jù)集中到近原子分辨率(~3-4-?免疫復(fù)合物圖譜在范圍內(nèi)重建，繞過單克隆抗體的分離步驟，簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu)分析。然而，由于抗體的多克隆特性和固有序列信息的缺乏，重建圖的真實(shí)原子分辨率受到限制，特定表位決定了簇的融合。

　　在cryoEMPEM圖中，我們開發(fā)了一種直接確定單抗序列的方法。這一混合方法包括電子顯微鏡(EM)和下一代一起測(cè)序(NGS)，使多克隆Fabs(Fv)可變區(qū)域的序列分配，包括互補(bǔ)決定區(qū)域(CDRs)。

　　結(jié)果

　　最近，我們使用了恒河猴免疫實(shí)驗(yàn)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，這是一個(gè)可溶性HIVEnv三聚體。本研究常用的三個(gè)主要cryoEMPEM圖譜/模型顯示，BG505SOSIP結(jié)合不同結(jié)構(gòu)的pAbs(圖1)。優(yōu)質(zhì)的低溫電子顯微鏡(33).3-3.7?分辨率)，與Fab相對(duì)應(yīng)的部分電子顯微鏡圖具有較高的局部分辨率(圖1)。

　　　具有BG505SOSIPCryoEMPEM圖譜，抗原和恒河猴單抗體。高分辨率圖譜(透明灰色表層)和相應(yīng)的免疫復(fù)合物模型(從左到右:Rh.4O9pAbC-1,Rh.33104pAbC-1，和Rh.33172pAbC-2).底部顯示完整的地圖和模型，頂部顯示表位-副表位界面的特寫視圖。絲帶表示用于模型(BG505SOSIP，深灰;Rh.4O9多克隆Fab，綠色;Rh.33104多克隆Fab，粉紅色;和Rh.33172多克隆Fab，綠)。我們只對(duì)多克隆Fabs的可變域進(jìn)行了建模。n-鏈聚糖表現(xiàn)為桿狀物和黃色。

　　第一，我們進(jìn)行了闡述Rh.4O9pAbC-1cryoEMPEM圖片(圖1，左)，顯示一個(gè)pAb組合在一起。BG505SOSIP抗原的V一環(huán)上。最初發(fā)布的數(shù)據(jù)采用圖中所示的集中分類方法進(jìn)行再處理。S二是降低異質(zhì)性，重建更高質(zhì)量V1pAb圖譜。識(shí)別該表位的單克隆抗體最近從同一只恒河猴子中分離出來。兩種抗體來自同一個(gè)復(fù)制家族。Rh4O9.7和Rh4O9.8中和了野生型BG505假病毒，并通過誘變發(fā)現(xiàn)靶向V一環(huán)。我們使用陰性染色電鏡。(nsEM)來表征Rh4O9.8抗體與BG505SOSIP融合，并得到驗(yàn)證V1的特異性。另外，Rh4O9.8單抗與來自Rh4O9pAbC-多克隆Fab疊加1。(圖2B)。

　　運(yùn)用Rh4O9.建立了8個(gè)序列Rh4O9pAbC-fab對(duì)應(yīng)部分原子模型(圖2)C)。該模型處于二級(jí)結(jié)構(gòu)水平(圖2D，左邊)和側(cè)鏈水平(圖2D，右邊)上與cryoEMPEM圖具有良好的一致性。每一個(gè)殘基Q評(píng)分圖都得到了驗(yàn)證Rh4O9.8抗體具有良好的整體模型-圖擬合，并在框架內(nèi)。(FW)與CDR區(qū)域的一致性很高?？偠灾?，結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，通過B細(xì)胞篩分分離出來的Rh4O9.通過低溫電子顯微鏡檢測(cè)出單克隆抗體的血清程度。V1針對(duì)單克隆抗體的復(fù)制家庭。

　　在上面的例子中，了解所選單克隆抗體的序列可以在原子程度上解釋低溫電子顯微鏡的密度。但考慮到抗體的多克隆特性和~3-4?結(jié)構(gòu)信息過于模糊，無法直接從結(jié)構(gòu)中確定最終cryoEMPEM圖譜分辨率的抗體序列。假設(shè)，如果合適的序列數(shù)據(jù)庫中有B細(xì)胞受體(BCR)圖庫在目的時(shí)間點(diǎn)與血清匹配(即pAb)集合是可用的，因此構(gòu)造信息包括cryoEMPEM圖譜可以用來選擇從這些數(shù)據(jù)庫中選擇重鏈和輕鏈序列的候選人。因此，我們開發(fā)了一種混合方法，利用cryoEMPEM圖譜和NGS數(shù)據(jù)中抗原特異性B細(xì)胞庫的結(jié)構(gòu)限制來識(shí)別單克隆抗體。

　　第一，為類似的解釋3-4-?在低溫電子顯微鏡圖中，我們開發(fā)了一個(gè)與相應(yīng)結(jié)構(gòu)類型(即每個(gè)氨基酸周圍的密度體積相關(guān)的確定性水平)相結(jié)合的分配系統(tǒng)。A)。取值是手動(dòng)實(shí)現(xiàn)的，每個(gè)氨基酸位置都有一個(gè)層次類別標(biāo)志符，對(duì)應(yīng)于最符合密度的預(yù)定氨基酸殘基子集。在這個(gè)過程的最后，用于定義CDR和已發(fā)表抗體結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)同源性FW區(qū)域性，從而導(dǎo)致抗體序列的初始分配。

　　針對(duì)BG505SOSIPV1環(huán)抗體的mAb和pAb構(gòu)造比較。(A)Rh4O9.8Fab與BG505SOSIPnsEM特性是三聚體復(fù)合物。BG505SOSIP三聚體(左：二維平均值，右：重建三維圖)?？贵w的位置顯示在箭頭上。(B)以Rh4O9.8mAbnsEM地圖的疊加(透明的白色表層)和特征Rh.4O9pAbC-1EMPEM低溫圖(BG505SOSIP，灰色;pAb，綠色)。(C)BG505SOSIP帶狀圖的原子模型。(肽，深灰色;糖，黃色)和Rh4O9.8mAb基于多克隆低溫EMPEM圖的原子模型(綠色)復(fù)合體，Rh.4O9pAbC-1(白色透明表層)。(D)特寫顯示Rh4O9.8mAb的重鏈(HC;頂部)和輕鏈(LC;底部)模型-地圖擬合，包括HCDR3和LCDR3部分(重鏈)。橄欖綠;輕鏈，森林綠;EM圖片，透明白色表面)。

　　下一步，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種優(yōu)化算法，以獲得兩個(gè)主要輸入：(i)NGS序列數(shù)據(jù)庫和預(yù)處理(ii)客戶定義，基于結(jié)構(gòu)的序列查詢(圖3C)。NGS數(shù)據(jù)由用戶集的長(zhǎng)度公差在序列分配步驟中確定的CDR長(zhǎng)度進(jìn)行預(yù)過濾。然后，該程序?qū)R搜索查詢和數(shù)據(jù)庫中的每個(gè)序列進(jìn)行非投射。根據(jù)特點(diǎn)查詢(FW1/2/3和CDR1/2/3)分割，每個(gè)特征都是單獨(dú)對(duì)齊的。匹配是根據(jù)NGS序列中指定的氨基酸類別和相應(yīng)氨基酸的一致性來決定的。對(duì)于給定位置的每一個(gè)匹配(在導(dǎo)出中描述為“)，分?jǐn)?shù)是根據(jù)相對(duì)抽象的類型計(jì)算的(1/Xi，Xi是位置I上可能有多少氨基酸?X)。不匹配(在導(dǎo)出中描述為“?”)得分為0。根據(jù)CDR長(zhǎng)度，導(dǎo)出對(duì)齊分?jǐn)?shù)和不對(duì)齊分?jǐn)?shù)。